Os diferentes Métodos de Extração

Os ácidos nucleicos são moléculas fundamentais para a vida, pois armazenam e transmitem informação genética. Por isso, na pesquisa científica, a extração desses ácidos é uma etapa crucial em muitos experimentos de biologia molecular. Hoje, existem diversos métodos disponíveis para extrair ácidos nucleicos de amostras biológicas, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens, e iremos abordar alguns deles nesse artigo!

Fenol-Clorofórmio

O método de extração de Fenol-Clorofórmio é amplamente utilizado e é considerado um método confiável e de baixo custo. Ele consiste em separar os ácidos nucleicos das proteínas e lipídios presentes na amostra, utilizando fenol e clorofórmio como solventes.

Separação das fases após centrifugação na extração por fenol-clorofórmio

O fenol e o clorofórmio são misturados com a amostra a ter seus ácidos nucleicos extraídos e esta mistura é centrifugada. Após a centrifugação, o fenol e o clorfórmio formam uma fase orgânica no fundo do tubo, enquanto os ácidos nucleicos ficam como um sobrenadante transparente. Este sobrenadante é então transferido para um novo tubo e lavado com reagentes alcoolicos para precipitar o ácido nucleico e purificá-lo.

A extração por Fenol-Clorofórmio é eficaz para extrair ácidos nucleicos de vários tipos de amostras, incluindo tecidos, sangue e bactérias. Porém, é uma metodologia trabalhosa, e requer destreza manual do executor para evitar contaminações. Além disso os reagentes são bastante tóxicos, podendo causar diversos danos se inalados ou se entrarem em contato com a pele. Por isso, é extremamente necessário o uso de uma Capela de Exaustão para a realização deste método

Coluna de Sílica

Outro método popular é a extração por coluna de sílica, chamado de "método de coluna" ou "coluninha" no dia-a-dia. É considerado um método fácil e com uma pequena possibilidade de automação.

Neste método utiliza-se silica como matéria-prima para purificar os ácidos nucleicos da amostra. A amostra a ter seus ácidos nucleicos extraídos é adicionada à coluna e é lavada com solventes específicos para remover as impurezas e purificar os ácidos nucleicos. As impurezas são removidas por centrifugação, enquanto que o material genético fica preso à silica na coluna. No final da extração, o material genético é eluído com água ou um tampão específico de armazenamento, fazendo com que se separe da sílica e possa sair da coluna por centrifugação também.

Esquema simples da extração por beads magnéticas. Adaptado de https://www.nature.com/articles/s41598-018-23766-9

Esse método é rápido e limpo no entanto, pode ser pouco preciso para amostras com baixa quantidade de material genético e é limitado pelo tamanho da centrífuga do laboratório, diminuindo a escalabilidade e dificultando a automação do processo.

Beads Magnéticas

Finalmente, a extração por beads magnéticas é um método mais recente, mas que vem ganhando popularidade devido a sua eficácia e praticidade. Esse método utiliza microesferas (beads) magnéticas revestidas que são adicionadas a amostra para isolar os ácidos nucleicos dos lisados celulares.

As beads se ligam aos ácidos nucleicos, e com a adição de um imã forte, são puxadas e separadas do sobrenadante. Este sobrenadante é então descartado e as beads com os ácidos nucleicos são lavadas e purificadas de quaisquer impurezas remanescentes. Na última etapa, se adiciona água ou algum tampão de eluição específico para separar as beads dos ácidos nucleicos, que ficam em solução, enquanto que as beads são descartadas.

Esta metodologia é útil para a maioria dos casos dos laboratórios, e é especialmente útil para amostras complexas como sangue total, plasma e tecidos. Além disso, possibilita a extração de material genético em amostras degradadas ou com baixa quantidade, tais como amostras forense.

Esquema simples da extração por beads magnéticas. Adaptado de www.cytivalifesciences.com

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Uma outra vantagem da extração por beads magnéticas é a possibilidade de automação e a escalabilidade do método. Por conta de não precisar de centrifugação, pode-se extrair simultaneamente centenas de amostras, e a utilização de um robô extrator remove quase que completamente o trabalho do operador, que pode realizar outras atividades dentro do laboratório

Comparativo de tipos de extração por beads magnéticas

Conclusão

Em resumo, a escolha do método de extração de ácidos nucleicos dependerá do tipo de amostra e dos objetivos do experimento. Cada método tem suas particularidades e a escolha do melhor método pode variar dependendo da situação específica. É importante notar que, independentemente do método escolhido, é crucial seguir as boas práticas de laboratório para garantir a qualidade e confiabilidade dos dados obtidos.