A Reação em Cadeia da Polimerase


A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma ferramenta biotecnológica que revolucionou a biologia molecular e o diagnóstico de doenças. É usado para copiar e amplificar com eficiência segmentos específicos de DNA ou RNA, permitindo medição e manipulação precisas do material genético. Neste artigo, abordaremos os diferentes tipos de PCR e como são utilizados em laboratório. Também exploraremos as possíveis aplicações da PCR e os benefícios que ela trouxe para a pesquisa médica e científica.

Breve histórico

A história da PCR inicia-se com a descoberta de enzimas resistentes ao calor, na década de 1960, nas bactérias extremófilas vivendo no Parque Nacional de Yellowstone, nos Estados Unidos. Embora um artigo de 1971 de Kjell Kleppe e colaboradores tenha descrito pela primeira vez um método de ensaio enzimático para replicar um fragmento curto DNA in vitro, esta ideia inicial da PCR não recebeu muita atenção na época, e a sua invenção é geralmente creditada a Kary Mullis em 1983.

No centro do método de PCR está o uso de uma enzima DNA polimerase capaz de suportar altas temperaturas, acima de 90°C, que são necessárias para a separação das duas fitas de DNA a cada ciclo de replicação. As primeira polimerases utilizadas eram incapazes de suportar essas altas temperaturas. Portanto, os primeiros procedimentos para a replicação do DNA eram muito ineficientes e demorados, e exigiam grandes quantidades de DNA polimerase e manuseio contínuo ao longo do processo.

A descoberta em 1976 da Taq polimerase – uma DNA polimerase purificada da bactéria termófila, Thermus aquaticus, que vive em fontes termais – abriu o caminho caminho para melhorias dramáticas do método de PCR. Esta enzima é estável em altas temperaturas, permanecendo ativa mesmo após a desnaturação do DNA a 90°C, evitando assim a necessidade de adicionar mais enzima a cada ciclo de replicação. Isso permitiu um processo automatizado com a criação dos primeiros termocicladores.

"Baby Blue", um dos primeiros protótipos de termociclador

Como funciona uma reação de PCR?

Para que uma reação moderna de PCR aconteça, são necessários alguns componentes básicos: uma solução tampão para conservar os reagentes, enzima polimerase capaz de suportar altas temperaturas, o DNA a ser amplificado, pelo menos um par de primers (iniciadores) – pequenas moléculas de DNA complementares à fita a ser copiada que servem como um primeiro local para a enzima se ancorar no DNA molde, e dNTPs –  nucleotídeos A T C G que serão incorporados pela polimerase para a produção das novas cópias de DNA.

As etapas na PCR são:

Desnaturação: as fitas de DNA molde são submetidas a altas temperaturas, fazendo com que se separem.

Anelamento dos primers: logo em seguida, a temperatura diminui para cerca de 50°C, e os primers se ligam às fitas de DNA.

Extensão: A temperatura sobe novamente para entre 60°C a 72°C, que é a temperatura ótima para a polimerase agir. A enzima se liga ao DNA e aos primers e “percorre” a fita de DNA criando uma cópia complementar incorporando os dNTPs.

Estas etapas são repetidas geralmente de 30 a 40 vezes, levando em média 1h30 a 2h para completar, a depender do tamanho do DNA que se quer amplificar.

 Esquema da reação de PCR. Imagem obtida de https://byjus.com/biology/pcr/

Quais são os diferentes tipos de PCR?

Existem diversas modificações desta reação clássica de PCR que servem para otimizar ou ter mais precisão em algum procedimento. Alguns exemplos são o Multiplex PCR, o MLPA, o Touchdown-PCR, o PCR digital, Hot-Start PCR e PCR em tempo real (qPCR e RT-qPCR). Aqui vamos nos ater ao PCR em tempo real, uma vez que o PCR clássico e o qPCR são de onde todas os outros derivam

O PCR em tempo real, como o próprio nome diz, tem como premissa a visualização em tempo real da reação de amplificação. Para isso se utiliza fluoróforos específicos que soltam fluorescência a cada ciclo de amplificação. Nos primeiros ciclos há pouquíssimo sinal, mas à medida que a reação se torna exponencial esta fluorescência aumenta e é detectada pelo termociclador. Estes fluoróforos podem ser adicionados através de um intercalante do DNA (por exemplo, o SYBR) ou através de um terceiro primer, chamado de probe, que contém o fluoróforo na sua ponta. Este fluoróforo é clivado quando a reação de PCR acontece e libera sua fluorescência

 Resultados de um PCR em tempo real. Imagem obtida de https://www.genengnews.com/magazine/265/improving-real-time-pcr-data-quality/

Aplicações da PCR

As aplicações da PCR são inúmeras nas diversas áreas da biotecnologia e da biologia molecular. Tanto na pesquisa quanto para diagnósticos clínicos, esta técnica permite muitos insights, ganho de tempo e escala no laboratório

A PCR permite o isolamento de fragmentos de DNA através da amplificação seletiva de uma região específica do DNA, de acordo com os primers utilizados. Isto é importante para obtenção de genes de interesse de um organismo para a engenharia genética e técnicas de DNA recombinante por exemplo.

Por sua amplificação exponencial e alta robustez de processo, a PCR permite a detecção de quantidades mínimas de DNA e em condições subótimas, como por exemplo, no estudo forense para detecção de criminosos ou vítimas, como foi realizado no ataque terrorista em 11 de setembro de 2001, ou até mesmo para reconstrução ancestral, como foi realizada para DNAs de mamutes e múmias.

Nas análises clínicas, é possível sua utilização para genotipagem dos pacientes ou detecção de DNA de patógenos, por exemplo. Na genotipagem, é possível detectar variantes genéticas potencialmente patogênicas, como em estudos oncogenéticos. A detecção de patógenos foi amplamente utilizada durante a pandemia, onde vimos noticiado com frequência o uso do RT-qPCR como padrão-ouro na detecção de pacientes acometidos.

 

Conclusão

Vimos neste post um breve histórico da PCR, suas aplicações e como funciona. Esta técnica é extremamente importante tanto em pesquisa quanto em diagnósticos clínicos, e rendeu aos idealizadores o Prêmio Nobel na época. Com o avanço tecnológico as técnicas de biologia molecular vão se aprimorando, permitindo maior sensibilidade e conseguir mais insights em cima dos objetos de estudo.

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